# 扫描电镜生物样品的临界点干燥制样流程

> 扫描电镜（SEM）生物样品从取材到上机的制样流程：戊二醛固定、锇酸后固定、梯度乙醇脱水、临界点干燥、粘台与镀膜，以及组织、细胞、花粉和细菌悬液的装样方法。

- 网页：https://www.kimax-cpd.com/articles/sem-sample-preparation.html
- 更新：2026-11-02

## 扫描电镜生物样品的临界点干燥制样流程

扫描电镜在真空中成像，生物样品要先干燥，再镀一层导电膜。组织、细胞、花粉这类含水的软样品，从取材到上机要经过固定、脱水、临界点干燥、粘台、镀膜五步，干燥后仍保持固定时的三维形貌。

北京世安科林 · KiMax 极境 · 2026-11-02

- **五个步骤**：固定 → 脱水 → 临界点干燥 → 粘台 → 镀膜
- **脱水终点**：纯度不低于 99.5% 的无水乙醇
- **全程要求**：从固定到装进样品仓，样品始终浸在液体里

### 风干会把软样品拉塌，临界点干燥不经过气液界面

电镜样品室处于高真空，含水样品放进去会失水变形，还会污染真空系统，生物样品因此要先干燥。难点在干燥本身：水从细胞和组织间隙中蒸发时，弯月面的表面张力把软结构拉向内侧，细胞表面起皱，微绒毛和纤毛倒伏，组织整体收缩。这些变形会被当成样品本身的形貌拍下来。毛细压力的来源与估算见[临界点干燥的原理与操作步骤](https://www.kimax-cpd.com/articles/critical-point-drying.html#capillary)。

生物样品常用的四种干燥方式

| 方式 | 做法 | 气液界面 | 常见用途 |
| --- | --- | --- | --- |
| 自然风干 | 样品在空气中直接蒸干 | 有，水的表面张力约 72 mN/m | 骨骼、外壳等硬质样品 |
| HMDS 化学干燥 | 无水乙醇换成六甲基二硅氮烷（HMDS），在通风橱中挥发 | 有，表面张力低于乙醇 | 结构较硬、数量较多的样品 |
| 冷冻干燥 | 样品冻结后在真空中升华 | 无，冻结时冰晶会挤压结构 | 能快速冷冻的小样品 |
| 临界点干燥 | 液态 CO₂ 换出乙醇，越过临界点后以气态排出 | 无 | 组织、细胞、花粉、昆虫等表面细节丰富的软样品 |

临界点干燥是扫描电镜生物样品的常规干燥方法。它对前处理只有一个硬性要求：孔隙里的水要先全部换成乙醇。下面按制样顺序逐步说明。

### 固定让结构在脱水前定型

取材后尽快浸入固定液。化学固定把蛋白质和膜交联起来，后面脱水和干燥时，细胞才不会变形。常见方案如下：

- **前固定**：2.5% 戊二醛，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液或二甲胂酸钠缓冲液配制，pH 7.2–7.4，4 °C 下 2 h 至过夜。
- **漂洗**：同一缓冲液漂洗 3 次，每次 10–15 min。
- **后固定**：1% 四氧化锇（锇酸）1–2 h，进一步固定脂类，也提高样品的导电性。锇酸剧毒、易挥发，全程在通风橱中操作。之后用缓冲液或蒸馏水再漂洗几次。

组织块切到几毫米以内，固定液才能渗透到中心。样品越小，后面脱水和置换所需的时间也越短。

### 梯度乙醇把水逐级换出

水和 CO₂ 几乎不互溶，进入临界点干燥前，样品里的水要全部换成乙醇。直接放进无水乙醇，浓度骤变会让细胞收缩，所以乙醇浓度逐级升高。

梯度乙醇脱水（常见方案）

| 乙醇浓度 | 每次时间 | 次数 |
| --- | --- | --- |
| 30% | 10–15 min | 1 |
| 50% | 10–15 min | 1 |
| 70% | 10–15 min | 1 |
| 80% | 10–15 min | 1 |
| 90% | 10–15 min | 1 |
| 95% | 10–15 min | 1 |
| 100% | 15–20 min | 3 |

最后三次用纯度不低于 99.5% 的无水乙醇，最好是新开瓶、或经分子筛除过水的乙醇。乙醇开瓶后会从空气中吸水，最后一级带进去的水，临界点干燥换不出来。

样品较厚时，每一级的时间相应延长：乙醇扩散所需的时间随厚度的平方增加，估算见[溶剂置换](https://www.kimax-cpd.com/articles/critical-point-drying.html#solvent-exchange)。需要中途停下时，样品可以停在 70% 乙醇中，4 °C 保存。

异丙醇（IPA）也可以用于脱水。丙酮同样常用；在 KiMax 极境干燥仪上用丙酮，需加装选配的丙酮套件。

### 样品在无水乙醇中转入样品仓

从脱水到装进样品仓，样品始终浸在无水乙醇里。先往样品仓加入足以没过样品的无水乙醇，再把样品架快速转入，尽量缩短样品接触空气的时间。哪怕表面只是短暂露出液面，也已经经历过一次弯月面。

不同形态的样品，装法不同：

- **组织块**：放在网板上，用组合样品笼分层叠装，上下透液。
- **花粉、种子、昆虫等小样品**：各占多孔承载件的一个编号孔位（A-1 至 A-8），干燥后不会混。
- **长有细胞的盖玻片**：细胞面朝上，平放在网板上。
- **细菌、细胞悬液**：脱水后的悬液直接装进径向密封样品笼，流体上进下出穿过样品层，颗粒留在笼内。

![编号多孔承载件与样品笼实物照片，孔位标记A-1至A-8](https://www.kimax-cpd.com/assets/images/fixtures-real/kmp-sample-cage-tray.webp)

![悬浊液干燥用径向密封样品笼实物照片](https://www.kimax-cpd.com/assets/images/fixtures-real/kmp-sample-cage-filter.webp)

### 液态 CO₂ 换出乙醇，再越过临界点

合盖后运行干燥程序：样品仓先冷却，液态 CO₂ 慢充进液、置换乙醇，加热越过 31.1 °C、7.38 MPa 的临界点，再保持加热匀速泄压。每一步的作用和起始参数见[九步干燥程序](https://www.kimax-cpd.com/articles/critical-point-drying.html#program)。

组织块较厚，或用多孔承载件叠装了很多样品时，延长置换时间或改用循环置换，把乙醇换干净。乙醇残留是生物样品干燥后仍然起皱的常见原因。

常做的样品，把验证过的参数存成配方，下次装样、合盖、选配方即可运行。

### 干燥后的样品粘台、镀膜，尽快上机

![电镜样品台上的花粉、组织与昆虫样品](https://www.kimax-cpd.com/assets/images/app-sem-stubs.webp)

干燥后的样品很脆，而且容易吸潮。用镊子夹取边缘，粘到铝制样品台的导电碳胶带上；需要更好的导电通路时，在样品边缘补一点导电银胶。

生物样品不导电，在电子束下会积累电荷。上机前用离子溅射仪镀一层金属膜，常用金、铂或金钯，厚度 5–10 nm；要做能谱（EDS）分析的样品改镀碳膜，避免金属峰的干扰。

当天不观察的样品，放进干燥器保存。

### 视频讲解

- [1:28 三个关键 · 01 样品笼与装样方式](https://www.kimax-cpd.com/assets/video/drying-key-01-sample-cage.mp4)
- [1:28 三个关键 · 02 溶剂置换与乙醇残留](https://www.kimax-cpd.com/assets/video/drying-key-02-solvent-exchange.mp4)

### 常见问题

#### 临界点干燥后样品表面起皱或塌陷，问题出在哪一步？

先查前处理：固定不充分，脱水时浓度跳得太快，或者转移时样品露出液面。再查干燥：最后一级乙醇吸了水，乙醇没有换干净，或者泄压太快。

#### 脱水做到一半，可以停下来吗？

可以停在70%乙醇中，4 °C保存，之后从70%接着往上脱。进入无水乙醇后，当天完成临界点干燥。

#### 细菌和细胞悬液怎么做临界点干燥？

固定和脱水时靠离心换液。干燥时可以先吸附到多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，或者滤到滤膜上；也可以把脱水后的悬液直接装进径向密封样品笼，颗粒留在笼内。

#### 临界点干燥前可以用丙酮脱水吗？

可以。丙酮和乙醇一样能与液态CO2互溶，最后一级同样要用无水丙酮。在KiMax极境干燥仪上用丙酮，需加装选配的丙酮套件。

#### HMDS化学干燥能代替临界点干燥吗？

对结构较硬、数量较多的样品，HMDS操作简单，是常用的替代方法。HMDS挥发时仍有气液界面，细胞表面微绒毛这类细微结构，通常用临界点干燥。

样品测试

### 样品测试与工艺评估

您提供样品与目标形貌，我们在 KiMax 极境干燥仪上完成置换、越过临界点与受控泄压的完整流程，反馈处理后的样品状态与选型建议。

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