扫描电镜生物样品的临界点干燥制样流程

风干会把软样品拉塌，临界点干燥不经过气液界面

电镜样品室处于高真空，含水样品放进去会失水变形，还会污染真空系统，生物样品因此要先干燥。难点在干燥本身：水从细胞和组织间隙中蒸发时，弯月面的表面张力把软结构拉向内侧，细胞表面起皱，微绒毛和纤毛倒伏，组织整体收缩。这些变形会被当成样品本身的形貌拍下来。毛细压力的来源与估算见临界点干燥的原理与操作步骤。

临界点干燥是扫描电镜生物样品的常规干燥方法。它对前处理只有一个硬性要求：孔隙里的水要先全部换成乙醇。下面按制样顺序逐步说明。

固定让结构在脱水前定型

取材后尽快浸入固定液。化学固定把蛋白质和膜交联起来，后面脱水和干燥时，细胞才不会变形。常见方案如下：

• 前固定：2.5% 戊二醛，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液或二甲胂酸钠缓冲液配制，pH 7.2–7.4，4 °C 下 2 h 至过夜。
• 漂洗：同一缓冲液漂洗 3 次，每次 10–15 min。
• 后固定：1% 四氧化锇（锇酸）1–2 h，进一步固定脂类，也提高样品的导电性。锇酸剧毒、易挥发，全程在通风橱中操作。之后用缓冲液或蒸馏水再漂洗几次。

组织块切到几毫米以内，固定液才能渗透到中心。样品越小，后面脱水和置换所需的时间也越短。

梯度乙醇把水逐级换出

水和 CO₂ 几乎不互溶，进入临界点干燥前，样品里的水要全部换成乙醇。直接放进无水乙醇，浓度骤变会让细胞收缩，所以乙醇浓度逐级升高。

最后三次用纯度不低于 99.5% 的无水乙醇，最好是新开瓶、或经分子筛除过水的乙醇。乙醇开瓶后会从空气中吸水，最后一级带进去的水，临界点干燥换不出来。

样品较厚时，每一级的时间相应延长：乙醇扩散所需的时间随厚度的平方增加，估算见溶剂置换。需要中途停下时，样品可以停在 70% 乙醇中，4 °C 保存。

异丙醇（IPA）也可以用于脱水。丙酮同样常用；在 KiMax 极境干燥仪上用丙酮，需加装选配的丙酮套件。

样品在无水乙醇中转入样品仓

从脱水到装进样品仓，样品始终浸在无水乙醇里。先往样品仓加入足以没过样品的无水乙醇，再把样品架快速转入，尽量缩短样品接触空气的时间。哪怕表面只是短暂露出液面，也已经经历过一次弯月面。

不同形态的样品，装法不同：

• 组织块：放在网板上，用组合样品笼分层叠装，上下透液。
• 花粉、种子、昆虫等小样品：各占多孔承载件的一个编号孔位（A-1 至 A-8），干燥后不会混。
• 长有细胞的盖玻片：细胞面朝上，平放在网板上。
• 细菌、细胞悬液：脱水后的悬液直接装进径向密封样品笼，流体上进下出穿过样品层，颗粒留在笼内。

液态 CO₂ 换出乙醇，再越过临界点

合盖后运行干燥程序：样品仓先冷却，液态 CO₂ 慢充进液、置换乙醇，加热越过 31.1 °C、7.38 MPa 的临界点，再保持加热匀速泄压。每一步的作用和起始参数见九步干燥程序。

组织块较厚，或用多孔承载件叠装了很多样品时，延长置换时间或改用循环置换，把乙醇换干净。乙醇残留是生物样品干燥后仍然起皱的常见原因。

常做的样品，把验证过的参数存成配方，下次装样、合盖、选配方即可运行。

干燥后的样品粘台、镀膜，尽快上机

干燥后的样品很脆，而且容易吸潮。用镊子夹取边缘，粘到铝制样品台的导电碳胶带上；需要更好的导电通路时，在样品边缘补一点导电银胶。

生物样品不导电，在电子束下会积累电荷。上机前用离子溅射仪镀一层金属膜，常用金、铂或金钯，厚度 5–10 nm；要做能谱（EDS）分析的样品改镀碳膜，避免金属峰的干扰。

当天不观察的样品，放进干燥器保存。

常见问题